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Western blot(免疫印跡實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)服務(wù)升級
更新時(shí)間:2016-03-28   點(diǎn)擊次數(shù):1183次

簡介:Western blot(免疫印跡實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)服務(wù)

提供商:信帆生物科技有限公司

服務(wù)名稱:Western blot實(shí)驗(yàn)服務(wù)

服務(wù)名稱標(biāo)本要求實(shí)驗(yàn)周期單位
WB(普通蛋白)組織、蛋白、細(xì)胞2周內(nèi)每張膜

 

Western blot簡介 


   蛋白質(zhì)印記又稱免疫印記,根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測樣品中的某種蛋白的方法。它是利用特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色,通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。

 

Western blot的原理 


   Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。

 

   以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。


 

Western blot樣本要求

客戶需新鮮或正確保存的蛋白樣品, 檢測目的蛋白的一抗(或由本公司代購)。樣品要求為:

 

1、裂解樣品總蛋白量>500ug/樣品。

2、細(xì)胞樣品總蛋白濃度>1mg/ml。

3、組織樣品總蛋白濃度>10-15mg/ml。

 

Western blot結(jié)果及數(shù)據(jù)提供

內(nèi)參蛋白和目的蛋白曝光膠片各一張,可提供掃描圖,實(shí)驗(yàn)報(bào)告,包括整個(gè)試驗(yàn)流程所涉及的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)步驟。如需進(jìn)行蛋白純化服務(wù),將提供檢測報(bào)告



Western blot實(shí)驗(yàn)服務(wù)

服務(wù)內(nèi)容

我們提供從蛋白制備、蛋白電泳到Western blot檢測的全流程服務(wù),如需要還可進(jìn)行灰度分析。

說明

1、建議提供目的蛋白陽性表達(dá)樣品(純蛋白或有陽性表達(dá)的細(xì)胞或組織)作為陽性對照。

2、每張膜檢測1-8個(gè)樣品。

3、如果一抗由客戶提供,請?jiān)谡_條件下保存,避免污染及反復(fù)凍融。

 


 

 

關(guān)于Western blot實(shí)驗(yàn)異常分析


『無信號』

原因建議
一抗與二抗不匹配選擇針對一抗來源種屬制備的二抗;
一抗不識別目的的種屬的蛋白

1)檢查抗體的說明書,適用范圍內(nèi)是否包含目的種屬
2)使用陽性對照來檢查抗體質(zhì)量

一抗或二抗不足,沒有足夠的抗體結(jié)合到目的蛋白

1)降低抗體稀釋倍數(shù),增加抗體濃度
2)延長孵育時(shí)間

封閉劑與一抗有交叉反應(yīng)改變封閉劑
抗原不足

1)每個(gè)泳道加入20-30ug總蛋白
2)制備樣品要使用蛋白酶抑制物及使用陽性對照

在檢測的組織內(nèi)目的蛋白表達(dá)水平低檢測樣本不表達(dá)目的蛋白選擇表達(dá)量高的細(xì)胞作為陽性對照,用于確定檢測樣本是否為陰性,也可更換細(xì)胞系
蛋白轉(zhuǎn)膜效率低

1)利用麗春紅檢測轉(zhuǎn)膜效率;檢查轉(zhuǎn)移裝置是否電極弄反
2)轉(zhuǎn)移前膜是否用甲醇侵泡過

膜過渡洗滌減少洗滌時(shí)間和強(qiáng)度
疊氮鈉抑制二抗活性二抗稀釋液內(nèi)不用疊氮鈉

 

 

『沒有特異條帶』

原因建議
細(xì)胞系傳代過多后蛋白表達(dá)譜發(fā)送變化1)使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細(xì)胞系進(jìn)行樣品制備
蛋白本身有很多修飾1)查閱文獻(xiàn),確定目的蛋白是否存在多種修飾
蛋白被消化或者降解1)蛋白樣品確保未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑
所檢測蛋白存在多種剪接體,導(dǎo)致分子量大小不同1)查閱文獻(xiàn)或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
一抗或二抗?jié)舛雀?/span>1)減低抗體濃度
洗滌不夠1)充分洗滌

 

 

『條帶大小不正確』

原因建議
目的蛋白被降解確保蛋白樣品未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑
存在不同的剪接體查閱文獻(xiàn)或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
重組蛋白檢測是否存在額外加入的蛋白
特殊蛋白如MDM2等仔細(xì)閱讀抗體說明書

 

 

尊敬的客戶:
本公司有放射免疫技術(shù)服務(wù)、蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)、免疫組化、PCR技術(shù)服務(wù)、生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析等,如果您想了解Western blot的更多內(nèi)容或者其他服務(wù)信息,您可以本公司的了解更多產(chǎn)品的詳細(xì)信息,至善至美的服務(wù)是我們永無止境的追求,歡迎新老客戶放心選購自己心儀產(chǎn)品,我們將竭誠為您服務(wù)!

 

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