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明膠酶譜試劑盒使用注意事項大總結！

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法，其基本原理1 和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結束后 取出凝膠與酶反應Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。

凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景， 但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區域，從而能 同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學 反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑 盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。

試劑盒使用注意：

1.制備聚丙烯酰胺時應注意排除氣泡。

2.明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子，和PH值等因素的影響，因此緩沖液配制應嚴格準確，盡量用超純水，孵育溫度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH在7.5-7.6，復性的TRITON時間長了會有絮狀物，所以實驗時盡量使用新鮮配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培養箱中，因為會改變孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6.細胞樣本用PBS 5倍體積震蕩裂解,估算細胞的體積，然后加入5倍體積的PBS，渦旋振蕩15-30s,而后靜置或低速離心.或者手動震蕩。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝 膠，并緩慢搖動2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的藍色的條帶 和干凈的背景（通常此過程需要2～4h，也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景）；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對 凝膠進行處理后保存。 安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學品操作規程處理。

明膠酶譜試劑盒使用注意事項大總結！