明膠酶譜分析試劑盒凝膠無法聚合是怎么回事！
我公司基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法（gelatin-zymography）電泳分析試劑是一種旨在通過明膠聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在分離、蛋白復(fù)性、底物水解、染色等一系列步驟下，觀察并半定量深藍(lán)色背景中的無色清晰的基質(zhì)金屬蛋白酶條帶，根據(jù)分子量確定特異基質(zhì)金屬蛋白酶及其活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞萃取樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）、培養(yǎng)上清懸液、血清和關(guān)節(jié)滑液或腦脊液等基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9，等活性及其抑制劑的檢測。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，條帶清晰，重復(fù)性好。
信帆生物生物科技有限公司一直貫徹客戶的原則為消費(fèi)者提供高品質(zhì)高性價比的科研產(chǎn)品。我們的產(chǎn)品貨期快、質(zhì)量品牌有保障，售后技術(shù)服務(wù)完善，是很多科研單位和高校的供貨商。
產(chǎn)品檢測步驟：
1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。
2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液。可通過預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker 即可。
陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。
注：因?yàn)槿煞謴?fù)雜,MMP活性較低，hao的方法是將全血中白細(xì)胞進(jìn)行分離做陽性對照
3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。
4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)。可先用適量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。
5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。
6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72(MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。
7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中常見的格式。
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參考文獻(xiàn)：
1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
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